DMD: Single CRISPR treatment bietet langfristige Vorteile, die in Mäuse: Genetische änderungen und protein-Restaurierung in Maus-Modellen der Duchenne-Muskeldystrophie lebensfähig bleiben ein Jahr nach der CRISPR-Behandlung

Forscher an der Duke University haben gezeigt, dass eine einzelne systemische Behandlung mit CRISPR-Genom-editing-Technik kann sicher und stabil zu korrigieren, eine genetische Krankheit — Duchenne-Muskeldystrophie (DMD) – für mehr als ein Jahr in Mäusen, trotz der beobachteten Immunantwort und alternative gene-editing-Ergebnisse.

Die Studie erscheint online am 18. Februar in der Zeitschrift Nature Medicine.

Im Jahr 2016, Charles Gersbach, die Rooney Familie Associate Professor für Biomedizinische Technik an der Duke, veröffentlicht eines der ersten erfolgreichen Verwendungen von CRISPR zur Behandlung von einem Tiermodell der genetischen Krankheit, die mit einer Strategie, die das Potenzial hat, übersetzt werden, – human-therapy. Viele weitere Beispiele wurden seitdem veröffentlicht, und mehrere Genom-editing-Therapien gezielt gegen menschliche Erkrankungen werden derzeit in klinischen Studien, mit mehr auf dem Weg.

Gersbach ‚ s neueste Forschung konzentriert sich auf ein Maus-Modell der Krankheit, die verursacht werden durch den Körper nicht produzieren dystrophin, eine lange protein-Ketten, die bindet das innere der Muskelfaser auf die support-Struktur.

Dystrophin kodiert durch ein gen mit 79 protein-kodierenden Regionen, die sogenannten exons. Wenn ein oder mehrere exons, unterbrochen oder gelöscht wird durch eine vererbte mutation, die Kette nicht gebaut werden, verursachen Muskel sich langsam zu vernichten und verderben. Die meisten Patienten sind an den Rollstuhl gebunden sind 10 Jahre alt und Leben nicht jenseits Ihrer 20er oder frühen 30er Jahre.

Gersbach wurde die Arbeit auf potentielle genetische Behandlungen für Duchenne-seit 2009. Sein Labor war eine der ersten zu Beginn der Fokussierung auf die CRISPR/Cas9, einer modifizierten version eines bakteriellen Abwehrsystem, dass Ziele und Scheiben abgesehen, das die DNA von eindringenden Viren. Sein Ansatz verwendet CRISPR/Cas9 zu snip aus dystrophin-exons um die genetische mutation, verlässt der Körper die Natürliche DNA-Reparatur-system zu Nähen die verbleibenden gene wieder zusammen, um eine verkürzte-aber funktional-version des dystrophin-Gens.

„Wenn wir uns weiterhin die Arbeit zu entwickeln CRISPR-basierte genetische Therapien, ist es wichtig zu testen, unsere Annahmen und konsequent beurteilen alle Aspekte dieses Ansatzes,“ Gersbach, sagte. „Ein Ziel unserer Experimente war es, zu testen, einige Ideen diskutiert, die im Feld, die uns helfen zu verstehen, das Potenzial von CRISPR zur Behandlung von genetischen Erkrankungen im Allgemeinen und Duchenne-Muskeldystrophie, insbesondere. Dies umfasst die überwachung der langfristigen Haltbarkeit der Reaktion im Angesicht der möglichen Immunreaktion gegen die Bakterien-Cas9-protein.“

Die ersten acht-Wochen-Studie gezeigt, dass die funktionale dystrophin wurde restauriert und die Muskelkraft erhöht. Es ging jedoch nicht auf, erkunden Sie die langfristige Haltbarkeit der Behandlung.

„Es wird weithin angenommen, dass gen, die Bearbeitung führt zu dauerhaften gen-Korrektur“,“ Gersbach, sagte. „Es ist jedoch wichtig zu untersuchen, theoretische Möglichkeiten, untergraben könnte, die Auswirkungen von gen-editing, wie zu verlieren behandelten Zellen oder die Immunantwort.“

Das Ziel der neuen Studie war die Erforschung von Faktoren, die sich verändern könnten, die langfristigen Auswirkungen des CRISPR/Cas9-basierte gen Bearbeiten.

Christopher Nelson, post-doctoral fellow in Gersbach ‚ s lab, leitete die Arbeit, bei der Verabreichung einer einzigen Dosis des CRISPR-Therapie intravenös, um sowohl die Erwachsenen und Neugeborenen Mäusen, die ein defektes dystrophin-Gens. Im Laufe des folgenden Jahres, Forscher gemessen, wie viele Muskelzellen wurden erfolgreich bearbeitet und welche Arten von genetischen Veränderungen vorgenommen wurden, sowie die Generierung von beliebigen Immunantwort gegen bakterielle CRISPR protein Cas9, die als „Schere“ , macht Einschnitte in das Genom.

Andere Studien haben berichtet, dass die Maus immun-system mounten kann, eine Antwort zu Cas9, die möglicherweise stören mit dem Vorteil des CRISPR-Therapien. Mehrere Gruppen haben berichtet, dass einige Leute haben bereits bestehende Immunität zu Cas9 Proteine, wahrscheinlich aufgrund der vorangegangenen Exposition auf die Bakterien-Wirt.

„Die gute Nachricht ist, dass, obwohl wir beobachteten beide Antikörper und T-Zell-Antworten zu Cas9, weder erschien das Ergebnis in eine Toxizität in diesen Mäusen,“ sagte Nelson. „Die Antwort auch nicht verhindern, dass die Therapie die Möglichkeit, erfolgreich zu Bearbeiten, ist das dystrophin-gen und produzieren Langzeit-protein-expression.“

Die Ergebnisse werden auch Ansätze vorgeschlagen, um mögliche Herausforderungen, die, sollte Sie in der Zukunft auftreten. Zum Beispiel, beobachteten die Forscher, dass, wenn zwei-Tage-alten Mäusen, ohne Sie vollständig entwickelt Immunsystem behandelt wurden, intravenös, keine Immunantwort festgestellt werden. Die CRISPR-Genom-Bearbeitung stabil geblieben und in einigen Fällen sogar verstärkt, die im Laufe des Jahres. Man könnte sich vorstellen, die Auslieferung der Therapie von Säuglingen als Methode zur Umgehung oder die Modulation eine unerwünschte Reaktion des Immunsystems.

Gersbach und Nelson bestätigen jedoch, dass die Maus Immunsystem fungiert oft ganz anders als das menschliche Immunsystem. Und Neugeborenen-screening für DMD ist derzeit nicht allgemein durchgeführt; die meisten Duchenne-Diagnosen auftreten, wenn die Kinder drei bis fünf Jahre alt. Um dieser Herausforderung zu begegnen, Gersbach, sagte unterdrücken das Immunsystem während der Behandlung kann ein brauchbarer Ansatz.

Die Forscher untersuchen auch mögliche Strategien zu beschränken, den Ausdruck oder die Lieferung von Cas9 nur die Muskelzellen für kurze Laufzeiten, die möglicherweise verringern die immun-Detektion.

„Wir waren sehr erfreut zu beobachten, dass alle Mäuse wurden gut ein Jahr nach der Behandlung, aber unsere Ergebnisse zeigen, dass es muss mehr Fokus auf die Immunantwort, wie wir uns bewegen in Richtung größere Tiermodelle,“ Nelson sagte.

Nelson und Gersbach zuvor untersucht das Potenzial von off-target-Bearbeitung von CRISPR/Cas9 unbeabsichtigt ändern andere stellen im Genom und berichtet minimale Aktivität bei wahrscheinlich off-target-sites. Andere aktuelle Studien haben jedoch berichtet, dass CRISPR manchmal genetische änderungen auf die richtige Seite, aber nicht in der vorgesehenen Weise. Zum Beispiel haben einige Studien gezeigt, dass CRISPR schneiden können genetische Abschnitte viel größer ist als gedacht oder dass DNA-Stücke durch das einbetten auf der Website von cut. Diese Arten von Bearbeitungen, die bisher nicht gemeldeten in der Genom-Bearbeitung von Studien, weil die Methoden, die verwendet wird, erfasst nur die beabsichtigte Bearbeiten.

Umfassend anzeigen alle Bearbeitungen Auftritt im dystrophin-gen, Nelson verwendet eine DNA-Sequenzierung Ansatz, agnostisch meldet jede Art von Bearbeitung. Überraschenderweise gab es viele Bearbeitungen gemacht, die neben der beabsichtigten Entfernung der gezielte exon, einschließlich eines hohen insertion von DNA-Sequenzen aus dem viralen Vektor Codierung des CRISPR/Cas9-system.

Abhängig von der Art des Gewebes und der Dosierung von CRISPR ausgeliefert, so viele wie die Hälfte des on-target-Bearbeitungen führte diese alternative Sequenz ändert. Obwohl dieses Ergebnis war überraschend, die unbeabsichtigte Folge von änderungen erscheinen nicht, um Einfluss auf die Sicherheit oder Wirksamkeit des CRISPR/Cas9-gen editing-Ansatz für DMD.

„Keiner von diesen Bearbeitungen möchte unbedingt ein Grund zur Sorge ist in diesem Fall, weil das dystrophin-gen ist bereits defekt,“ sagte Nelson. „Dass gesagt wird, die unbeabsichtigte Ergebnisse potenziell Weg von der Effizienz des gene editing, die Sie versuchen zu erreichen, unterstützt die Bedeutung der Gestaltung von wegen, Objektiv zu ermitteln und zu mindern, alternative änderungen in zukünftigen Studien.“

„Frühere Studien vorgeschlagen, dass einige der anderen Arten von Bearbeitungen, die passieren könnte,“ Gersbach, sagte. „Aber dies ist eine der ersten umfassenden Messungen dieser Ereignisse in einem Tier-Modell mit einem therapeutisch relevanten Ansatz. Sich vorwärts zu bewegen, dieses Phänomen muss sorgfältig überwacht werden und besser verstanden werden. Methoden, die vermeiden, dass diese alternative Bearbeitungen und erhöhen Sie die Häufigkeit der beabsichtigten Bearbeiten wird wichtig sein, um zu maximieren das Potenzial der Genom-Bearbeitung zu behandeln.“